Samuel L. Jackson groeide op in Tennessee en studeerde aan het Morehouse College in Atlanta. Hij werd er ooit van school gestuurd na het opsluiten van leerkrachten tijdens een studentenprotest, maar keerde later wel terug om er 'dramatic arts' te volgen. Hij studeerde af in 1972 en verhuisde daarna naar New York. Zijn filmdebuut Together For Days maakte hij terwijl hij nog aan Morehouse studeerde. In de jaren 70 en 80 kon hij zijn acteermicrobe vooral kwijt op de planken, in stukken zoals 'Home, A Soldier's Play', 'Sally/Prince' en 'The District Line'. Hij creëerde ook rollen in toneelstukken van August Wilson in het Repertory Theater. In 1981 verscheen hij voor de eerste keer in een 'film met naam' : een bijrolletje in Milos Formans Ragtime.

Zijn carrière op het witte doek ging pas echt van start eind jaren tachtig. Spike Lee castte hem in 1988 voor School Daze en Jackson was meteen ook te zien in de drie volgende films van de Afro-Amerikaanse cineast : Do The Right Thing, Jungle Fever en Mo'Better Blues. Voor zijn vertolking van crackverslaafde in Jungle Fever kreeg hij op het Festival van Cannes de speciale 'Best Supporting Performance Award', een prijs die de jury speciaal voor hem in het leven riep. Hij ontving ook een New York Film Critics Award voor Jungle Fever. De vertolking en de prijs hielpen hem om steeds meer op het voorplan te komen : zo speelde hij in 1993 in maar liefst vijf films waaronder de kaskraker Jurassic Park en de cult-films Menace II Society en True Romance. Zijn grote doorbraak (en daaraan gekoppeld ook zijn sterrenstatus) heeft hij te danken aan Quentin Tarantino die hem caste als de filosoferende huurmoordenaar Jules in Pulp Fiction (1994). Een rol waaraan hij zowel een Academy Award nominatie als een Golden Globe nominatie overhield. In Engeland werd de BAFTA-nominatie zelfs verzilverd in een heuse BAFTA Award.

Jackson is één van de hardwerkendste acteurs in Hollywood, en een jaar zonder één of meerdere films met de acteur in een hoofd- of bijrol is schier ondenkbaar. Hij was reeds in meer dan 80 films te zien en is overigens de acteur wiens films in de filmgeschiedenis tot nu toe het meest geld opgebracht hebben !  Een greep uit het aanbod : Deep Blue Sea, Tarantino's Jackie Brown (waarvoor hij een Zilveren Beer voor beste acteur op het Festival van Berlijn en een Golden Globe nominatie ontving), Die Hard With A Vengeance en Unbreakable (beiden aan de zij van Bruce Willis), Rules Of Engagement, The Negotiator, Shaft, de Grisham-verfilming A Time To Kill (alweer een prijsbeest met een Golden Globe nominatie en een NAACP Image Award) en The Red Violin). Ook op het kleine scherm werd Jackson reeds genomineerd. Voor zijn rol in John Frankenheimers Against The Wall in 1994 ontving hij een Golden Globe nominatie en een Cable Ace nominatie, beiden voor beste mannelijke bijrol.

In 2004 was hij te horen als de superheld Frozone in The Incredibles.  Hij leende overigens ook zijn stem aan het titelpersonage van Afro Samurai, een animatie-reeks die voor het eerst te zien was op 'Spike Television in januari 2007 en ondertussen ook al een tweede seizoen kent.  Andere films met Jackson zijn ondermeer Changing Lanes, S.W.A.T., Coach Carter, XXX en de sequel XXX : State of the Union, de Star Wars-prequels, en het anti-apartheidsdrama Country Of My Skull waarvoor hij in de zomer van 2003 naar Zuid-Afrika reisde.

In 2007 verschenen de drama's Home of the Brave en het integraal in Memphis opgenomen Black Snake Moan van Craig Brewer Hustle & Flow) met Christina Ricci en Justin Timberlake, een film die overigens het Filmfestival van Sundance opende.  Ook 1408 had aardig wat succes aan de Box-office.

In 2008 was Samuel L. Jackson nog te zien in Resurrecting The Champ waar hij de rol vertolkte van een aan alcohol verslaafde ex-bokser die in contact komt met een journalist (Josh Hartnett) die een verhaal wil schrijven over zijn succesvolle jaren in de ring.  Hierna was de acteur nog te zien in ondermeer de science-fiction thriller Jumper met Hayden Christiansen, het drama The Cleaner van Renny Harlin, Lakeview Terrace van Neil LaBute, en Iron Man 2.

Het actie-genre lijkt zijn favoriete soort films te blijven, getuige daarvan zijn rol in Thor in 2011.