John Hubley volgde zijn opleiding aan het Art Center van Los Angeles. In 1935 kreeg hij de mogelijkheid om de stiel van/als artdirector te leren bij de Disney Studio’s. Zo werkte hij bijvoorbeeld mee aan Fantasia, Pinocchio, Snow White and the Seven Dwarfs en Bambi. Hij was nog in dienst van de studio toen er in 1941 een staking uitbrak. Die zorgde er voor dat Hubley en een aantal van zijn collega's de overstap maakten naar de Columbia/Screen Gems studio. Korte tijd hierna begonnen hij en enkele van zijn collega's met het maken van trainingsfilms voor de First Motion Picture Unit tijdens de Tweede Wereldoorlog. Een aantal van hen ware mede verantwoordelijk voor een campagnefilm voor president Roosevelt, getiteld Hell Bent for Election en geregisseerd door Chuck Jones.
Een aantal van hen waren verantwoordelijk voor de opstart van UPA (United Productions of America). Daar maakte John Hubley vijf jaar deel uit van de directie en was hij verantwoordelijk voor de algemene leiding van de organisatie. Die drukte een belangrijke stempel op de Amerikaanse animatiefilm. Zo was men bijvoorbeeld voorstander van een stijl zonder veel tierlantijntjes maar met verfijnde ontwerpen én met een absolute voorkeur voor menselijke eigenschappen bij de personages. De film Brotherhood of Man was een pleidooi voor verdraagzaamheid én een steun voor een groep mensen die in het zuiden als doel hadden vakbonden op te richten.

In 1955 richtte Hubley samen met zijn echtgenote Faith, zelf een film- en muziekmonteur en scriptcontroleur, hun eigen maatschappij op onder de naam Storyboard Productions. Die maakten naast tv-commercials vooral intelligente, soms educatieve maar bovenal leuke animatiefilms. Bij een aantal van hun films trad zijn vrouw op als producente, schrijfster en animatrice. Het paar was zo succesvol dat men in hun carrière meer dan dertig onderscheidingen ontving.

Hurley was ook medebedenker van het personage van Mr. Magoo, eigenlijk gebaseerd op een nonkel. Meer nog, hij regisseerde zelfs de eerste animatiefilm met het personage, Ragtime Bear. Later werkte hij ook aan documentaires in het animatie-genre op een moment dat die zich nog in een experimentele fase bevond.
Het was ook in deze periode van zijn carrière dat hij en zijn vrouw hun voorliefde voor jazz, vertaalden in hun werk. Dizzy Gillespie, Benny Carter en Quincy Jones waren maar enkele van hun favorieten die bekroond werden met filmprijzen waaronder Oscars. Herb Alpert and the Tijuana Brass Double Feature (1966) is hier maar één voorbeeld van, de volledige lijst zie je onderaan deze biografie.

Na het overlijden van John Hubley zette zijn echtgenote Faith Hubley zijn werk verder met originele en uitdagende films, hierbij geholpen door haar dochters Georgia en Emily én zoon Mark. Die waren ook al verantwoordelijk voor soundtracks van John en Faiths vroegere films, toen men, zonder dat die het zelf wisten, opnames maakte van hen.

John Hubley was ook verantwoordelijk voor de regie van het stuk animatie in de langspeelfilm The Four Poster (1952).